D-熒光素鉀鹽，D-蟲熒光素鉀鹽；D-Luciferin potassium

分子式：C11H7KN2O3S2    分子量：318.41   CAS 號：115144-35-9

一：背景簡介：哺乳動物發光，一般是將螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)基因整合到需觀察細胞的染色體DNA上，以表達熒光素酶，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時，熒光素酶也會得到持續穩定的表達。標記后的熒光素酶只有在活細胞內才會產生發光現象，并且發光強度與標記細胞的數目呈線性相關。除螢火蟲熒光素酶外，有時也會用到海腎熒光素酶(renilla luciferase)。二者的底物不同，螢火蟲熒光素酶的底物是熒光素(D-luciferin,常見鉀鹽或者鈉鹽)。二者的發光波長也不一樣，前者發光波長在540-600 nm,后者發光波長在460-540nm。熒光素所發的光更容易透過組織，在體內代謝較慢，而且特異性好。所以大部分活體成像實驗采用螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因。

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應用于整個生物技術領域，特別是體內活體成像技術。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發光。當熒光素過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染入細胞后，導入研究動物如大、小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。目前有三種產品形式：D-熒光素（游離酸），D-熒光素鹽（鈉鹽和鉀鹽）。主要差別在于溶解特性：前者的水溶性以及緩沖體系的溶解性都較弱，除非溶于弱堿如低濃度NaOH和KOH溶液。可溶于甲醇和DMSO；后者能夠易溶于水或緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內實驗。配成溶液后的這三種產品，在絕大多數的應用上都沒有實質性的差別。  根據文獻及客戶使用習慣，目前使用熒光素鉀鹽的較為常見。

美侖自主研發的D-熒光素鉀鹽，具有純度高，溶解性好，發光強度高衰減慢等特點，媲美進口產品。目前已經實現批量化生產，批產量高達100克以上。

產品用途：D-Luciferin作為熒光素酶的底物，存在于多種發光生物體中。在ATP和熒光素酶的催化作用下，熒光素被氧化，產生藍綠色的光(560nm)，當底物過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、細菌、哺乳動物細胞的常見報告基因。由于沒有背景干擾，因此可以很容易檢測出低至0.02 pg水平的熒光素酶。廣泛應用與活體成像報告基因檢測等領域。

 

二：meilunstar D熒光素鉀產品技術指標及操作方法

技術指標

中文名（Chinese synonym）	D-熒光素鉀鹽；D-蟲熒光素鉀鹽
英文名（English synonym）	D-Luciferinpotassium,D-Luciferin firefly, potassium salt
CAS號（CAS NO.）	115144-35-9
分子式（Formula）	C11H7N2O3S2 K
分子量（Molecular weight）	318.41 g/mol
外觀（Appearance）	淡黃色粉末
溶解性（Solubility）	易溶于水（30 mg/mL）
純度（Purity）（HPLC）	≥98%
儲存條件：	避光-20℃儲存
運輸條件：	2-8度

操作方法

體外生物發光試驗熒光素試劑的制備
材料
—D-熒光素，鉀鹽（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—無菌純水(美侖貨號MA0028)
—完全培養基（自行配置）
步驟
1. 用無菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動至熒光素完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。
2. 將D-luciferin，potassium salt 溶解于預熱好的組織培養基中制備成濃度為150 μg/ml的工作液。用組織培養基1∶100稀釋儲存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)。
3. 去除培養細胞的培養基。
4. 圖像分析前，向細胞培養板中添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析。
—注射器濾膜過濾除菌，0.2 μ m
*提示：成像前在37℃下對細胞進行短時間孵育可增強信號。

 

活體成像分析
材料 
—D-熒光素，鉀鹽（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—D-PBS,不含鈣、鎂（細胞培養級）(美侖貨號MA0010)
1：配制溶液

使用無菌D-PBS（w/o Ca2+ ;Mg2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液（15mg/ml），0.22µm濾膜過濾除菌（避光），分裝后于-20℃或-80℃冷凍保存，避免反復凍融。使用時4℃融化，實驗前平衡至室溫（避光） 

2：注射量取決于注射方式，具體如下：

注射方式	劑量
靜脈注射（25-27gauge針頭）	按10µl/g體重濃度，加入相應體積的15mg/ml熒光素工作液
腹腔注射（25-27gauge針頭）	按10µl /g體重濃度，加入相應體積的15mg/ml熒光素工作液
肌肉注射（27gauge針頭）	50µl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液
鼻內注射（pipette）	50µl，濃度為3mg/ml熒光素工作液

3： 注射入體內10-20 min（待光信號達到最強穩定平臺期），再進行成像分析。
注意：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。如果有條件，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩定性和保存時間更長，長達1年。 注射方式，動物類型以及體重等都會影響信號的發射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定最佳信號平臺期和最佳的檢測時間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應用上沒有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發表的文獻來看，鉀鹽的使用率遠高于鈉鹽，尤其是體內實驗。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

三：產品測試結果展示及文獻發表

 

1 結構確定（HNMR核磁氫譜）

H-NMR譜圖，由以上譜圖可以看出，美侖產品結構正確。

2 純度檢測（HPLC高效液相）

 

HPLC譜圖，由以上譜圖可以看出，美侖產品純度非常高。

3 熒光強度驗證

 

采用美國BioTek HTX多功能熒光酶標儀，對meilunstar D熒光素鉀鹽進行驗證，對照產品為進口P公司。雙盲對照，結果顯示，倆者在熒光強度及動力學指標上無顯著差異

圖A：D-LuciferinK螢光信號強度檢測

 

圖B： D-LuciferinK螢光信號穩定性（動力學）檢測。等量的螢火蟲螢光素酶，分別加入含有300μg/ml D-LuciferinK 的經典螢火蟲螢光素酶發光緩沖溶液（含 ATP、CoA、Mg2+ ），從反應初始時刻持續追蹤螢光信號60s，可以發現meilunstar D-LuciferinK的螢光信號強度與信號穩定性均與進口公司無顯著差別。（儀器：BioTek HTX） 

4 溶解性測試

 

室溫條件下，用純水作為溶劑 測試溶解性，30MG/ML濃度，易溶解，澄清度良好。

5 活體成像實例。

 

6 細胞實驗D-熒光素鉀鹽體外生物發光試驗

材料：

—D-熒光素鉀鹽（D-luciferin potassium salt，美侖貨號MB1834）
—無菌純水（美侖貨號MA0028）
—完全培養基（自行配制）

步驟：
1. 貼壁細胞：將細胞接種于培養板中孵育數小時或過夜，使細胞貼壁。懸浮細胞：可以將細胞接種于培養板后直接進行后續操作，無需孵育。如果倍增時間相對較短，則應考慮倍增時間進行細胞計數。

2.將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動至熒光素鉀鹽完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。

3. 用預熱好的細胞培養基1∶100稀釋100X熒光素儲備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。

4. 去除培養板中的培養基。

5. 在成像前，將適量熒光素工作液加入細胞中，然后進行圖像分析。注意：成像前在37℃下對細胞進行短時間孵育可增強信號。孵育時間取決于特定的細胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據需要進行測試和調整。

6. 每隔10分鐘，最多40分鐘，使用VILBER FUSION FX成像系統檢查體外生物發光，確定動力學曲線并找出細胞的峰值成像時間點。

 

結果：（見下圖A）

 

圖A：D-luciferin體外生物發光動力學曲線。使用美侖D-luciferin檢測轉染pML-NFκB-Fluc2-Neo質粒（美侖貨號MA0504）后的293T細胞，VILBER FUSION FX成像系統下每5min檢測螢光信號一次，持續追蹤40min。動力學曲線顯示，美侖D-luciferin作為底物的細胞生物發光衰減較慢，40min后螢光信號強度僅衰減25%左右。

 

7 近期使用meilunstar D熒光素鉀鹽發表文獻舉例

 

(1). Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma

期刊：BIOMATERIALS 影響因子：10.273

(2)Hypoxia-responsive lipid-poly-(hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles for glioma chemo- and radiotherapy. 

期刊：Theranostics；影響因子：8.06

(3)Theranostic size-reducible and no donor conjugated gold nanocluster fabricated hyaluronic acid nanoparticle with optimal size for combinational treatment of breast cancer and lung metastasis

期刊：JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE  影響因子：7.901

(4)Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy.  

 期刊：International Journal of Nanomedicine  影響因子：4.47

(5)Self-assembled angiopep-2 modified lipid-poly (hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles delivery TMZ for glioma synergistic TMZ and RT therapy

期刊：DRUG DELIVERY  影響因子：3.829

(6)Angiopep-2 Modified Cationic Lipid-Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid Delivery Temozolomide and DNA Repair Inhibitor Dbait to Achieve Synergetic Chemo-Radiotherapy Against Glioma

 期刊：JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY  影響因子：1.093